Мои шесть соток: Серия книг Мои 6 соток | издательство МСП
Мои 6 соток
Другие записи про экскурсию по участкуНе очень-то я публичный человек, страшновато мне каждый раз что-то показывать, да еще и застенчива до коликов. Потому и редко пишу. Но попадешь в компанию увлеченных и доброжелательных людей и на многое смотришь легче и проще. А еще у меня есть на…
Походив в гости в течении недели к семидачникам, решила пригласить к себе в неизвестный отчасти эколентяйный цветник и садик ! Неизвестный для меня, так как, меняясь с соседками семенами и рассадой, я получила в обмен неизвестные мне цветы…
25 июля. Каждодневный утренний обход «владений». С прошлого года это стало своего рода ритуалом: сначала из-за появления очень активного щенка, который умудрялся за ночь «пересадить» по собственному усмотрению кучу растений.
Продолжаю рассказывать о своих огородных экспериментах :) Овощной цветник В прошлый сезон (кто помнит) с южной стороны теплицы я разбила небольшую грядочку. Тогда я там арбузики сажала, а когда большая часть не выросла, засеяла листовой…
Годы идут, сад становится «взрослым». Когда-то я с нетерпением ждала, чтобы поднялись деревья и дали спасительную тень. И вот пришло время, когда ее, тени, уже предостаточно, иногда даже в избытке. Приходится брать в руки пилу и пускать солнечные…
Периодически расцветает какой-нибудь куст розы.
Буйного цветения нет, но взгляд на них задерживается
Такая вот красотка расцвела
А эта подружка продолжает набирать бутоны
Еще один клематис продолжает цвести.
Правда, еще…
Шесть соток в Германии: мой сад — моя крепость | Культура и стиль жизни в Германии и Европе | DW
Бывает, что на вопрос: «Куда едешь в этом году в отпуск?» — немцы шутливо отвечают: «В страну Балконию». Несколько квадратных метров балконной площади, на ней столик и мангал, тент от солнца, цветы в горшках или лук с петрушкой в ящиках с землей, а то даже и клубника, дополняют антураж этого мини-оазиса. Но есть вид домашнего отдыха популярнее, чем Балкония. Это собственный садовый участок, немецкие «шесть соток».
Место семейной идиллии
Любовь к родному саду-огороду — в немецкой традиции. Даже из малюсенького клочка земли перед городским домом хороший хозяин умудрится создать обворожительный цветничок. Привезет интересной формы камень, посадит декоративный кустарник и «анютины глазки» или просто поставит красивый цветочный горшок с искусно подстриженным самшитом.
Чтобы обзавестись палисадником или даже небольшим садом, немцам вовсе не обязательно селиться за городом или ездить туда каждые выходные. Для архитектуры многих городов Германии характерны выходящие фасадом на проезжую часть улицы многоквартирные дома с задним двориком. Ну, а малосемейные дома обязательно строят с садиками. Такого садика площадью 100 или даже 200 квадратных метров вполне хватает для потребностей всех членов семьи. Детям помладше поставят горку и качели, для особо спортивных — небольшой батут, летом наливают воду в надувной бассейн. Отец семейства разожжет жаровню, мама посадит пару кустов роз, помидоры и зелень для салата, а старшая сестра будет загорать на шезлонге.
О зеленом газоне, неотъемлимом элементе немецкого сада, заботится, как правило, глава семьи. Сад, заросший одуванчиками, — такой же позор для хозяина немецкого дома, как и пресловутые ненаточенные ножи. Мужским делом считается и подрезка живой изгороди, если таковая имеется, и, конечно же, все, что касается приготовления мяса, колбасок и прочего на гриле, начиная с разведения огня.
Бюргерские традиции и забота о бедных
Садово-огородная культура в Германии уходит корнями в начало XIX века. В эпоху бидермейера в садах обывателей появились популярные до сих пор зеленая лужайка, вьющиеся по стене дома дикие розы и горшки с геранью. Во второй половине XIX века врач Мориц Шребер (Moritz Schreber), заботясь о здоровье жителей бедных городских кварталов, начал создавать первые садовые кооперативы. Там дети могли подышать свежим воздухом, а родители получили возможность выращивать овощи и фрукты, обогащавшие витаминами скудный семейный рацион.
С тех пор эти дачи называют «садиками Шребера» (Schrebergarten). Они сохранили свою популярность в Германии и по сей день. Долгое время такие садовые участки считались воплощением мещанской культуры и были уделом почти исключительно пенсионеров. Но с недавнего времени работой и отдыхом в садиках Шребера не гнушается и молодежь.
В последние годы садоводство в городах получило новый импульс, дав начало культурному тренду под названием Urban Gardening.
Объясняют появление этого тренда по-разному. Некоторые эксперты называют Urban Gardening проявлением протеста против капиталистической системы, другие указывают на то, что горожане истосковались по природе, а третьи уверены, что нелегальное садоводство представляет собой особую форму молодежной культуры.
Кризис не страшен
Но вернемся к традиционным садам и огородам. Их популярность не падает, о чем свидетельствует процветание предприятий, торгующих семенами, рассадой, саженцами и всяческой садово-огородной утварью, инструментами, садовой мебелью и и т. д. По подсчетам объединения Industrieverband Garten, оборот этой отрасли в Германии составляет около 15 миллиардов евро в год.
Показательно, что даже во время экономического кризиса немцы не стали меньше инвестировать в свои шесть соток.
Напротив, потребность в собственном садике, месте, где можно отвлечься, расслабиться, почувствовать себя королем по принципу «мой сад — моя крепость», лишь выросла. Остается только добавить, что сад — это еще и место общения с друзьями, возможность практиковать трудотерапию, а для кого-то и статусный символ.
Фильм Шесть соток счастья (6 соток счастья): фото, видео, список актеров
Мелодрама с Екатериной Семёновой, Дмитрием Ячевским и Виталием Кудрявцевым в главных ролях.
Фильм «Шесть соток счастья» снял режиссер Юрий Лейзеров («Рыжая», «ППС-2» и др.) по сценарию Максима Демченко
(«Второе дыхание», «Морские дьяволы. Смерч»). В картине, помимо исполнителей главных ролей, снялись актеры: Екатерина Соломатина, Иван Колесников, Александра Булычёва, Павел Лемешко, Руслан Калимуллин, Мария Сигал, Юрий Гумиров и др.Премьера мелодрамы «Шесть соток счастья» состоялась 21 июня 2014 года на телеканале «Россия 1».
Сюжет фильма Шесть соток счастья
Застав своего мужа состоятельного бизнесмена Павла в обьятиях молодой красивой девушки на своем рабочем столе, Наталья в состоянии аффективного эмоционального потрясения, не сдерживая слез и крика, безоглядно бежит сквозь весь город. Иссякшие силы приводят Наталью к мысли все оставить и уехать в заброшенный загородный дом своих родителей в «Ягодное».
Ее сын Никита (Павел Лемешко) тем временем возвращается из Америки, где проходит учебу в колледже и застает ту же картину, что и Наталья, но только уже у себя дома. Узнав, что мама в «Ягодном», Никита немедленно едет к ней. Неожиданная встреча в «Ягодном» Натальи с Дмитрием пробуждает в нем прежние чувства давних романтических отношений к ней … Ревность или страсть, месть или прощение — героям нужно искать основы для новой жизни, но сделать этот выбор нелегко.
Съемочная группа фильма Шесть соток счастья
Режиссер: Юрий Лейзеров
Сценарист: Максим Демченко
Операторы: Дмитрий Маковеев, Светлана Серова
Композитор: Игорь Бабаев
Художник: Елизавета Лавинская
Продюсеры: Анастасия Кавуновская, Андрей Кретов, Александр Плотников
Производство: кинокомпания RUmedia
В ролях: Екатерина Семёнова, Дмитрий Ячевский, Виталий Кудрявцев, Екатерина Соломатина, Иван Колесников, Александра Булычёва, Павел Лемешко, Руслан Калимуллин, Мария Сигал, Юрий Гумиров, Виктор Рябов, Карим Пакачаков, Алексей Рядинский
Новые идеи для сада и огорода — цветник на участке 6 соток (15 фото-идей)
Сегодня я рада предложить вам, мои дорогие читатели и подписчики, новые идеи для сада и огорода.
Накопилась очередная порция интересностей, которыми я и хочу с вами поделиться. Оформление сада с помощью необычных приемов дизайна всегда привнесет струю свежего воздуха даже в уже сложившееся пространство.
На фото вверху вы видите идеи по украшению глухой стены забора. Обычно в наших краях люди любят маскировать глухой забор кустарниками, деревьями. А хозяин этого сада решил, что стена забора может стать хорошим плацдармом для того, чтобы устроить «выставку цветов» или хотя бы красивых кашпо.
Кашпо могут быть одинаковыми, но достаточно покрасить их в разные цвета и такая выставка уже будет интересной. Как вариант — в горшки можно посадить не только комнатные цветы, но и садовые. Махровые петунии, анютины глазки — любые неприхотливые цветы будут смотреться хорошо в этой выставке.
Сделайте свой сад более интересным и удобным местом для отдыха. Повесьте пару гамаков, купите или сделайте своими руками горку для детей, повесьте качели, устройте песочницу… благодаря этим элементам сад не будет выглядеть однообразным.
Устроив в саду мощеную площадку-патио вы решите сразу две проблемы — вам будет где принять гостей или посидеть вечером с семьей, плюс к этому, вы «обживете» еще один уголок сада.
Участки, которые остались не занятыми под огород и сад можно просто засадить газонной травой! От этого приусадебная территория только выиграет. На зеленом газоне очень любят играть дети. Регулярный полив и стрижка сделают его крепким и устойчивым к вытаптыванию.
Если вы любите садовничать и что-то мастерить, то вам обязательно понадобится беседка и маленькая симпатичная мастерская, где бы вы могли хранить инструменты и создавать свои рукотворные шедевры. Как вариант, можно соорудить оранжерею и выращивать там особенно ценящие тепло растения.
Если вы любите изысканный колорит сада, то вам наверняка подойдет идея сделать круглую площадку в саду. На ней можно поставить столик, шезлонг и зонтик, а пространство вокруг площадки украсить наподобие открытой комнаты.
Визуальными границами этой комнаты могут быть выставленные цветы в вазонах, рабатка, повешенное на дерево панно (как на фото) или картина.
Обычная скамейка в укромном уголке сада также добавит уюта. Ну а уже от самой скамейки будет зависеть, насколько вам будет удобно отдыхать. Рядом с садовыми скамейками выигрышно смотрятся пышные шапки гортензий.
Декоративные фонтаны заслуженно пользуются популярностью в садовом искусстве. Чаши и стойки можно вылить из цемента самостоятельно, проявив творческое начало.
Сейчас в продаже есть большой выбор больших и маленьких фонтанчиков, которые достаточно подключить к электричеству и залить в них воду, и они украсят двор, или любой уголок сада.
Журчание воды превосходно снимает стресс, успокаивает, расслабляет, настраивает на созерцательный лад.
Маленькие милые фигурки животных или птиц могут стать украшением вашего газона или клумбы.
Не бойтесь подходить к украшению сада с юмором — излишняя серьезность еще никого не сделала счастливым.
Играйте с пространством сада! Экспериментируйте и создавайте свою собственную сказку на любимой территории.
Если вам понравилась эта моя подборка идей, и вы хотите получать свежие идейки первыми, то подпишитесь на мою почтовую рассылку. Я много путешествую по миру и снимаю массу интересного материала, которым с удовольствием готова поделиться с вами!
Видео — как создать цветник на 6 сотках
Поделиться ссылкой:
Библиотека ГАУЗ МКДЦ — Мои 6 соток. Сад, огород, цветник
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Мой участок
Планировка н благоустройство садово-огородного участка
Почвы, их пригодность для садово-огородных культур
Экспресс-анализ
кислотности почвы
Способы обработки почвы
Посевной материал
Севообороты и совместимость культур на участке
Строчка из семян
Если ударили заморозки
Самодельные этикетки
Дом для растений
Разборные теплицы
Простые парники
Обогрев теплицы
Ремонт полимерной пленки
Стекольные работы
Против вредителей и заморозков
Чем подкармливать растения
Что мы знаем об удобрениях
Приспособления для подкормки растений
Защита от вредителей и болезней
Вредители и болезни плодово-овощных культур
2.
Мой огород
Луки
Чеснок
Салаты и зеленные культуры
Шпинат
Редис
Репа
Свекла
Морковь
Петрушка
Сельдерей
Огурцы
Тыква и кабачки
Томаты
Картофель
Горох
Фасоль
Капуста
Укроп
Фенхель
Ароматные травы
Редкие культуры
3. Мой сад
Земляника
Малина
Крыжовник
Смородина
Яблоня
Опора жителям сада
4. Календарь садовода и огородника
5. Мой цветник
Летники
Размножение летников
Двулетники
Размножение двулетников
Многолетники
Первоцветы
Красота цветника
Для тех, кому некогда
Вредители и болезни цветочных культур
Газоны
Альпинарии
Камни в саду
Цветы в букете
Друзья и враги
6.
Календарь цветовода-озеленителя
7. Приложения
Приложение 1
Перспективные овощные культуры
Капуста белокочанная
Капуста краснокочанная
Капуста брюссельская
Капуста савойская
Кольраби
Капуста цветная
Брокколи
Лук репчатый
Шнитт-лук
Лук-порей
Огурцы для открытого грунта и пленочных тоннелей
Гибриды Fl-пчелоопыляемые
Огурцы для теплиц
Кабачки
Кабачки цуккини
Патиссоны
Тыква
Томаты
Томаты для открытого грунта
Томаты для защищенного грунта
Перец сладкий
Баклажаны
Горох овощной
Фасоль
Морковь столовая
Свекла листовая (мангольд)
Свекла столовая
Редис
Редька
Репа
Петрушка
Петрушка корневая
Петрушка кудрявая
Петрушка листовая
Салат кочанный
Сельдерей
Приложение 2
Совместимость овощных культур
Приложение 3
Совместимость овощных культур в смешанных посевах
Приложение 4
Растения, влияющие на вредных насекомых
Приложение 5
Что, чем, когда и как сеять и сажать
Три десятичных знака — тысячные
Это полный урок с инструкциями и упражнениями по десятичным дробям с тремя десятичными цифрами: запись их в виде дробей, разметка и развернутая форма, а также десятичные дроби в числовой строке.
Он рассчитан на 5 класс.
В видео ниже я объясняю десятичные дроби с тремя десятичными цифрами — или тысячными — с использованием дробей и числовой строки. Затем я показываю примеры преобразования дробей в десятичные и наоборот.
Этот квадрат иллюстрирует целиком .Делится на
Третья десятичная цифра из десятичной
точка — тысячная цифра. Читать весь набор из трех десятичные цифры как число, и говорят «тысячные.”
| ||||||||||||
| ||||||||||||
Пока 0. Потому что 8/10 равно 800/1000, а 2/100 равно до 20/1000. Итак, когда вы сложите 8/10, 2/100 и 5/1000, вы получите 825/1000. |
391 читается как «391 тысячная». Как
дробь, это
это
825 — это сумма 8/10, 2/100 и 5/1000, это также 825/1000 (825 тысячных). 1. Напишите числа в развернутом виде. Запишите их также как дроби. Первый сделан для тебя.
|
| ||||||||||||||||||||||||
|
| ||||||||||||||||||||||||
|
|
2.Эти числа также
сотни, десятки и единицы. Напишите числа в развернутом виде. Следуйте примеру
.
| ||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||
|
3.Запишите десятичные дроби в таблицах разрядов и в виде дробей.
а. семитысячные
| б. 8 десятых и 2 тысячные
| г. 3 и 371 тысячные
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
г. 39 тысячных
| e. 1 и 41 сотые
| ф. 7 и 4 тысячные
|
4. Пишите в развернутом виде.
а. 0,95 =
б. 1,405 =
г. 244,781 =
г. 65,05 =
e. 20,214 =
В этой числовой строке есть отметки на каждой сотой. Цифры 0,052, 0,145, 0,228 и 0,304 нанесены на номер. линия. Может ты их найдешь? | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Напоминание: Вы можете «Теги» нулей в конце десятичного числа, и его значение не изменится:
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Для тысячных мы
нужно будет разделить каждый такой интервал на десять новых интервалов.
Представьте, что между каждыми двумя отметками есть девять маленьких линий.
Это будут тысячные доли.
5.Заполните детали, которые вы получите.
Если разделить одно целое на десять равных частей, получится _________________________________.
Когда вы разделите одну десятую на десять равных частей, вы получите _________________________________.
Когда вы разделите сотую часть на десять равных частей, вы получите ______________________________.
6. Запишите десятичные дроби, указанные стрелками.
а. ____________ б. ____________ c. ____________ г. ____________ эл. ____________
7. Отметьте эти десятичные дроби на числовой строке: 0,187, 0,205, 0,252, 0,301 и 0,314.
8. Запишите дроби десятичными дробями.
|
|
|
| ||||||||||||
|
|
|
| ||||||||||||
|
|
|
|
179. Записывайте дроби или смешанные числа.
| а. 0,048 | б. 3,902 | г. 3,005 | г. 6,7 |
| e. 10,06 | ф. 12,060 | г. 7,90 | ч. 0,429 |
| i. 505,5 | Дж. 4,789 | к. 0,091 | л. 5,42 |
10. Какое число образовано из «частей»? Дайте ваш ответ в виде десятичной дроби.
|
| ||||||||||||
|
| ||||||||||||
|
|
11.Десять десятых составляют одно целое. Мы можем записать это как
умножение: 10 × 0,1 = 1. ( Примечание: слово
«Делает» соответствует знаку равенства, но нет слова, чтобы
соответствуют знаку умножения; подразумевается
. ) Заполните предложения ниже и запишите произведение умножения.
предложение, чтобы соответствовать каждому.
Подсказка: Изображение большого квадрата в первом
страница этого урока может помочь.
| а. ________ тысячных составляет сотую. | _______ × _______ = _______ | |
| б. ________ сотых составляет десятую. | _______ × _______ = _______ | |
| г. ________ тысячных составляет десятую. | _______ × _______ = _______ | |
| г. ________ сотых составляют одно целое. | _______ × _______ = _______ |
12.Используйте диаграмму разметки, чтобы помогите вам, и напишите десятичную дробь, которая будет ….
на одну десятую больше, чем 0,285 _________ на сотую больше, чем 0,285 _________ на одну тысячную больше 0,285 _________ |
на одну десятую больше, чем 0,016 _________ на сотую больше, чем 0,016 _________ на одну тысячную больше 0,016 _________ | ||||||||||||||||||||||||||
на одну десятую больше, чем 1.07 _________ на сотую больше, чем 1.07 _________ на одну тысячную больше 1,07 _________ |
на одну десятую больше, чем 0,9 _________ на сотую больше, чем 0,9 _________ одна тысячная больше 0,9 _________ | ||||||||||||||||||||||||||
на пять десятых больше, чем 2.316 _________ на шесть сотых больше чем 2.316 _________ две тысячных больше 2,316 _________ |
на десять больше, чем 1.08 _________ на сотую больше, чем 1.08 _________ девяти тысячных больше 1,08 _________ |
13. Поместите числа в головоломку с числами. | ||
Поперечный: а. двухтысячные и 49 тысячных c. две и 7 сотых d. пять сотых e. 71 сотка ф. 392 тысячных | Вниз: а. 2 и девять сотых г. c. 2 и пять десятых г. 3 тысячных e. две десятых | |
3 и 76 тысячныхЭтот урок взят из книги Марии Миллер Math Mammoth Decimals 2, размещенной на сайте www.HomeschoolMath.net с разрешения автора. Авторские права © Мария Миллер.
Математика Мамонт Десятичные 2
Самообучающийся рабочий текст для 5-6 классов, охватывающий четыре операции с десятичными знаками до трех десятичных знаков, с упором на десятичное умножение и деление. В книге также рассматриваются разряды, сравнение, округление, сложение и вычитание десятичных знаков. Есть много проблем с умственной математикой.
Скачать (6,25 $) .Также доступен в печатном виде.
=> Узнайте больше и посмотрите бесплатные образцы!
Как найти половину, треть или любую часть числа — Полный курс арифметики
Пример 16.
Процент, означающий треть.
а) На недавнем экзамене треть класса получила «А». Какой процент получил «А»?
Ответ . Поскольку весь класс составляет 100%, то треть класса будет составлять треть от 100%.Мы должны разделить 100 на 3. Это не будет целое число. (Урок 11.)
| 100 3 | = | 99 + 1 3 | = 33 + | 1 3 | = 33 | 1 3 | . |
| 33 | 1 3 | % класса получили А. |
| Итак, мы видим, что 33 | 1 3 | % означает треть. |
Опять проц частей 100%. (Урок 15.) Точно так же, как 50% означает половину — потому что 50 — это половина от 100 — и 25% означает четверть, потому что 25 — это четверть от 100, поэтому 33% означает треть.
33 — треть от 100.
б) Какой процент означает две трети?
| Ответ . Две трети 100 будут 2 × 33 | 1 3 | : |
| 2 × 33 | 1 3 | = | 2 × 33 | + 2 × | 1 3 | . |
| 2 × 33 | = 66.2 × | 1 3 | = | 1 3 | + | 1 3 | = | 2 3 | . |
| 2 × 33 | 1 3 | = | 66 | 2 3 | . |
| 66 | 2 3 | % означает две трети. |
В разделе 2, вопрос 10 мы увидим простой способ найти четверть или 25% числа.
Пример 17. Задача калькулятора. Сколько стоит пять восьмых от 650 долларов . 16?
Решение .Чтобы найти , пять, восьмых, мы должны сначала найти , одну, восьмую. Нажмите
650 . 16 ÷ 8
См. 81 . 27
Пять восьмых будет
5 × 81 . 27 = 406 . 35
На простом калькуляторе задачу можно решить последовательно, нажав
650 . 16 ÷ 8 × 5 =
Две теоремы
Мы видели, что
Половина 100 + Половина 12 = Половина (100 + 12).
Вот теорема:
| 1. | Сумма одинаковых частей чисел является той же частью суммы этих чисел. |
Евклид, VII, 5. | |
Пусть число A будет частью числа C, а число B будет той же частью числа D.
Тогда сумма A и B будет той же частью суммы C и D.
Ибо, поскольку A является той же частью C, что и B в D, в C столько же чисел, сколько и в D, равных B.
Следовательно, разделите C на числа, равные A, а именно G, H, I,
, и разделите D на числа, равные B, а именно J, K, L;
, таким образом, C и D были разделены на одинаковое количество частей.
Тогда, поскольку G равно A, а J равно B, сумма G и J равна сумме A и B.
По той же причине сумма H и K и сумма I и L также равны сумме A и B.
Следовательно, сколько чисел в C равно A, столько же в сумме C и D равно сумме A и B.
Следовательно, какое бы кратное C ни было для A, сумма C и D является таким же кратным сумме A и B.
Следовательно, какая бы часть A ни была из C, сумма A и B является той же частью суммы C и D.
Это то, что мы хотели доказать.
*
Это свойство чисел также верно для частей множественного числа. Например:
Три пятых от 100 + Три пятых от 10 = Три пятых (100 + 10).
Вот теорема:
| 2. | Сумма одинаковых частей чисел равна одинаковых частей суммы этих чисел. |
| Евклид, VII, 6. | |
Пусть число A состоит из тех же частей числа C, что и число B числа D.
Тогда сумма A и B будет теми же частями суммы C и D.
Ибо, поскольку A — это те же части C, что и B для D, в A столько же чисел, что и часть C, сколько в B равно части D.
Разделите A на числа, равные части C, а именно G, H, I.И разделите B на числа, равные части D, а именно J, K, L;
, таким образом, A и B были разделены на одинаковое количество частей.
Тогда, поскольку G является той же частью C, что и J из D, сумма G и J является той же частью суммы C и D. (Теорема 1.)
По той же причине сумма H и K, а также сумма I и L также являются той же частью суммы C и D.
Следовательно, какие бы части A ни были из C, сумма A и B является теми же частями суммы C и D.
Это то, что мы хотели доказать.
Поскольку это истинные теоремы арифметики, аксиома факторизации алгебры,
ab + ac = a ( b + c ),
можно применить к арифметике — при умножении на
дробь определяется, как в Уроке 27.
На этом этапе, пожалуйста, «переверните» страницу и выполните несколько задач .
или
1-й урок о частях натуральных чисел
Введение | Главная | Содержание
Авторские права © 2021 Лоуренс Спектор
Вопросы или комментарии?
Эл.
Почта: [email protected]
Как Airbus объединяет части A380
(CNN) — Середина ночи в сонном французском городке Левиньяк, в сельской местности недалеко от Тулузы.
Люди выстроились в очередь вдоль главной дороги города в ожидании начала парада. Но на этом мероприятии в час ночи нет марширующих оркестров или украшенных поплавков.
Вместо этого появляется колонна из шести грузовиков, каждый из которых тянет за собой огромный прицеп, перевозящий массивный компонент крупнейшего в мире пассажирского авиалайнера Airbus A380.
Толпа аплодирует, когда крылья, секции фюзеляжа и горизонтальное оперение медленно продвигаются по провинциальному городу — процессия, которая повторяется каждые несколько недель.
Флот Airbus путешествует через город Левиньяк.
Предоставлено Airbus
Комплект для гигантского самолета
Конечная сборочная линия (FAL) для двухэтажного самолета А380 на 500+ пассажиров находится на заводе имени Жан-Люка Лагардера, специально построенном в аэропорту Тулуза-Бланьяк юг Франции.
Здесь также находится штаб-квартира Airbus и отдел летных испытаний, где строятся узкофюзеляжные A320 и широкофюзеляжные A330 и A350.
С момента первой поставки Singapore Airlines в 2007 году более 200 самолетов A380 сошли с линии в Тулузе.Большинство самолетов, более 100 самолетов, принадлежат авиакомпании Emirates, базирующейся в Дубае.
Как и в случае с другими проектами Airbus, производство компонентов для A380 распространяется на предприятиях компании по всей Европе, а запчасти поставляются поставщиками со всего мира.
Крылья мегаджета построены в Бротоне, Уэльс; секции фюзеляжа поставляются из Гамбурга, Германия, и Сен-Назера, Франция; Горизонтальное оперение производится в Кадисе, Испания; и вертикальное оперение также производится в Гамбурге.
Доставка этих огромных самолетов на FAL — это тщательно организованный логистический процесс, которым руководит Арно Казенев, менеджер по наземным перевозкам негабаритных грузов Airbus.
От заклепок и болтов до сидений и двигателей — A380 состоит из примерно четырех миллионов отдельных деталей, производимых 1500 компаниями из 30 стран мира.
«На мой взгляд, один А380 состоит из шести компонентов: трех секций фюзеляжа, двух крыльев и горизонтального оперения», — говорит Казенев.
Суда ро-ро
Детали, слишком большие для перевозки по воздуху, перевозятся во Францию на специально спроектированных судах.
Любезно предоставлено Airbus
Airbus имеет флот из трех специально спроектированных судов для перевозки основных компонентов A380 к плавучему понтонному доку в Пойяке, недалеко от берега Атлантического побережья Франции.
Суда с роликами, роликами или ро-ро перевозят шесть завершенных секций A380 с заводов Airbus в Уэльсе, Германии, Франции, Италии и Испании.
«Нет необходимости в работе подъемного крана», — говорит Казенев CNN Travel.
«Каждое производственное предприятие ставит секции на транспортировочное приспособление, и для его перемещения под приспособление проходит специальная универсальная машина.
« Мне не нужно прикасаться к секции, достаточно просто перенести компонент с одного транспортного средства.
к другому «.
Шесть по морю, один по воздуху
Пока шесть основных компонентов А380 находятся в морском круизе, вертикальное хвостовое оперение самолета летит из Гамбурга в Тулузу.
Первый полет плавника происходит не снаружи самолета, а внутри одного из супер-транспортеров Airbus A300-600ST, более известного как Beluga.
Эти сильно модифицированные грузовые авианосцы начали свое существование как широкофюзеляжные пассажирские самолеты. Кабина каждого самолета была опущена, чтобы разместить на фюзеляже пещерный грузовой отсек.
Парк из пяти самолетов Beluga соединяет предприятия Airbus в Европе, доставляя компоненты на FAL для всех самолетов Airbus.
Несмотря на то, что Beluga спроектирован для перевозки негабаритных грузов, он может вместить только вертикальное оперение A380 — все остальные основные секции мегаджета слишком велики.
Тем временем в Пойяке шесть основных компонентов А380 выгружаются, а затем перемещаются на одну из двух барж для следующего этапа полета в Тулузу.
Баржи совершают четыре обратных рейса за восемь дней, преодолев 95 километров вверх по реке Гаронна до Лангона. Но оттуда до FAL в Тулузе еще 240 километров.
По мере того, как каждый крупный компонент прибывает в Лангон, он перемещается в специально разработанный трейлер. Как только все шесть секций прибудут, можно начинать путешествие в Тулузу.
Поездка
Колонна движется по специально модифицированным дорогам от Лангона до Тулузы для доставки комплектующих.
Любезно предоставлено Airbus
Путешествуя только ночью, колонна за два вечера преодолевает 240 километров до Тулузы по маршруту Itinéraire à Grand Gabarit (IGG) — второстепенному маршруту, который был изменен с учетом экстремальных размеров A380. разделы.«Между Лангоном и Тулузой, до A380, была дорога, управляемая французскими властями», — говорит Казенев.
«Когда мы разрабатывали проект, мы пришли к властям и сказали:« Мы хотели бы передать эти большие компоненты по этому маршруту »».
Airbus оплатил 57% затрат на модернизацию дороги в размере 171 млн евро (205 млн долларов) , а правительство выплатило оставшиеся 43%, признавая экономическую выгоду, принесенную региону проектом А380.
Дороги расширились, препятствия переместились с обочины. Было посажено более 6500 деревьев, что в три-четыре раза превышает количество вырубленных.
Были построены специальные объездные дороги, чтобы колонне было легче перемещаться по некоторым из 21 города и деревни на пути следования.
Наряду с множеством других изменений были перестроены кольцевые развязки, чтобы грузовики могли проезжать прямо по центру транспортных развязок.
Было проложено более 35 километров велосипедных и конных дорожек с использованием новой широкой полосы отвода.
Эти огромные детали самолета превращаются в А380, крупнейший в мире пассажирский лайнер.
Предоставлено Airbus
Приветствие героя
«Когда вы едете по дороге, вы чувствуете, что он используется в A380, — говорит Казенев.
«Вы знаете, что это нечто иное, чем обычная дорога».
Календарь, показывающий запланированные даты движения конвоев, доступен на веб-сайте IGG, а местным жителям напоминается за три дня до начала движения каждого конвоя с помощью придорожных стендов.
Поскольку грузовики движутся в ночное время, маршрут частично закрыт для обычного движения, как для обеспечения безопасности конвоя, так и для безопасности конвоя, а затем идет город Левиньяк.
Вместо объездной дороги колонна идет прямо через центр города. Это единственная часть IGG, где каждый грузовик сопровождают корректировщики, идущие рядом с трейлерами — и не зря.
«Расстояние между компонентом и зданиями составляет всего 50 сантиметров с каждой стороны. Люди в зданиях смотрят, как компоненты проходят мимо, прямо перед их окнами», — говорит Казенев.
Проехав Левиньяк, вы всего в часе езды до конечной остановки конвоя, у FAL в Тулузе.
Казенев может потерять сон, но регулярно уезжает из Тулузы посреди ночи.
«Я довольно часто хожу посмотреть на конвой, чтобы убедиться, что все в порядке».
Индикаторы изменения климата: атмосферные концентрации парниковых газов | Показатели изменения климата в США
Техническая документация
Список литературы
1. IPCC (Межправительственная группа экспертов по изменению климата).2013. Изменение климата 2013: основы физических наук. Вклад Рабочей группы I в Пятый оценочный доклад МГЭИК. Кембридж, Соединенное Королевство: Издательство Кембриджского университета. www.ipcc.ch/report/ar5/wg1.
2. IPCC (Межправительственная группа экспертов по изменению климата). 2013. Изменение климата 2013: основы физических наук. Вклад Рабочей группы I в Пятый оценочный доклад МГЭИК. Кембридж, Соединенное Королевство: Издательство Кембриджского университета. www.ipcc.ch/report/ar5/wg1.
3. IPCC (Межправительственная группа экспертов по изменению климата).
2013. Изменение климата 2013: основы физических наук. Вклад Рабочей группы I в Пятый оценочный доклад МГЭИК. Кембридж, Соединенное Королевство: Издательство Кембриджского университета. www.ipcc.ch/report/ar5/wg1.
4. IPCC (Межправительственная группа экспертов по изменению климата). 2013. Изменение климата 2013: основы физических наук. Вклад Рабочей группы I в Пятый оценочный доклад МГЭИК.Кембридж, Соединенное Королевство: Издательство Кембриджского университета. www.ipcc.ch/report/ar5/wg1.
5. [см. Полный список ниже]
6. [см. Полный список ниже]
7. [см. Полный список ниже]
8. AGAGE (Расширенный глобальный эксперимент по атмосферным газам). 2016. База данных ALE / GAGE / AGAGE. По состоянию на июнь 2016 г. http://agage.mit.edu/.
9. Rigby, M. Обновление данных, первоначально опубликованных в: Arnold, T.
, C.M., 2016 г. Harth, J. Mühle, A.J. Мэннинг, П. Саламе, Дж. Ким, Д.Дж. Айви, Л.П. Стил, В.В. Петренко, Ю.П. Северингхаус, Д. Баггенстос, Р.Ф. Вайс. 2013. Глобальные выбросы трифторида азота, оцененные на основе обновленных атмосферных измерений. P. Natl. Акад. Sci. США 110 (6): 2029–2034. Данные обновлены в июле 2016 г.
10. NOAA (Национальное управление океанических и атмосферных исследований). 2016. Группа «Галоуглероды и другие микробы в атмосфере» (HATS).По состоянию на июнь 2016 г. www.esrl.noaa.gov/gmd/hats.
11. НАСА (Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства). 2013. Данные — информационные продукты TOMS / SBUV TOR. По состоянию на ноябрь 2013 г. http://science.larc.nasa.gov/TOR/data.html.
12. НАСА (Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства). 2015. Данные по тропосферному озону от AURA OMI / MLS.
По состоянию на май 2015 г. http://acdb-ext.gsfc.nasa.gov/Data_services/cloud_slice/new_data.html.
13. НАСА (Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства). 2016. Объединенный набор данных по озону SBUV (MOD). Версия 8.6. По состоянию на март 2016 г. http://acdb-ext.gsfc.nasa.gov/Data_services/merged/index.html.
14. IPCC (Межправительственная группа экспертов по изменению климата). 2013. Изменение климата 2013: основы физических наук. Вклад Рабочей группы I в Пятый оценочный доклад МГЭИК. Кембридж, Соединенное Королевство: Издательство Кембриджского университета. www.ipcc.ch/report/ar5/wg1.
Концентрации парниковых газов в атмосфере: цитаты для рисунков 1, 2 и 3
Рисунок 1
EPICA Dome C и станция Восток, Антарктида: приблизительно с 796 562 г. до н.э. по 1813 г. н.э.
Lüthi, D., M. Le Floch, B. Bereiter, T. Blunier, J.
-M. Барнола, У. Зигенталер, Д. Рейно, Ж. Жузель, Х. Фишер, К. Кавамура и Т.Ф. Stocker. 2008. Рекорд концентрации углекислого газа с высоким разрешением 650 000–800 000 лет назад. Природа 453: 379–382. www.ncdc.noaa.gov/paleo/pubs/luethi2008/luethi2008.html.
Лоу Доум, Антарктида, 75-летняя сглаживание: приблизительно с 1010 г. до н.э. — 1975 г.
Этеридж, Д.М., Л.П. Стил, Р.Л. Фрэнси, Ж.-М.Барнола, В.И. Морган. 1998. Исторические записи CO 2 из ледяных кернов Law Dome DE08, DE08-2 и DSS. В: Тенденции: сборник данных о глобальных изменениях. Ок-Ридж, Теннесси: Министерство энергетики США. По состоянию на 14 сентября 2005 г. http://cdiac.ornl.gov/trends/co2/lawdome.html.
Станция Сипле, Антарктида: примерно с 1744 г. до н.э. по 1953 г. 1994. Историческая запись содержания углекислого газа в ледяном керне станции Сипле.В: Тенденции: сборник данных о глобальных изменениях. Ок-Ридж, Теннесси: Министерство энергетики США.-500x500.jpg)
По состоянию на 14 сентября 2005 г. http://cdiac.ornl.gov/trends/co2/siple.html.
Мауна-Лоа, Гавайи: с 1959 г. до н.э. 2015 г.
NOAA (Национальное управление океанических и атмосферных исследований). 2016. Среднегодовые концентрации углекислого газа для Мауна-Лоа, Гавайи. По состоянию на 14 апреля 2016 г. ftp://ftp.cmdl.noaa.gov/products/trends/co2/co2_annmean_mlo.txt.
Барроу, Аляска: 1974 г. — CE 2014 г.
Мыс Мататула, Американское Самоа: 1976 г. — 2014 CE
Южный полюс, Антарктика: 1976 CE — 2014 CE
NOAA (Национальное управление океанических и атмосферных исследований)2016. Среднемесячные концентрации углекислого газа для Барроу, Аляска; Мыс Мататула, Американское Самоа; и Южный полюс. По состоянию на 14 апреля 2016 г. ftp://ftp.cmdl.noaa.gov/data/trace_gases/co2/in-situ/surface.
Кейп-Грим, Австралия: с 1992 г. по 2006 г. н.э.
Шетландские острова, Шотландия: с 1993 г.
по 2002 г. по н.э.
Steele, L.P., P.B. Круммель и Р.Л.Лангенфельдс. 2007. Атмосферные концентрации CO 2 (ppmv) получены из проб воздуха в колбах, собранных на мысе Грим, Австралия, и Шетландских островах, Шотландия.Организация Содружества научных и промышленных исследований. По состоянию на 20 января 2009 г. http://cdiac.esd.ornl.gov/ftp/trends/co2/csiro.
Остров Лампедуза, Италия: с 1993 г. по 2000 г. н.э.
Шамар, П., Л. Чиатталья, А. ди Сарра и Ф. Монтелеоне. 2001. Запись содержания углекислого газа в атмосфере по измерениям в колбах на острове Лампедуза. В: Тенденции: сборник данных о глобальных изменениях. Ок-Ридж, Теннесси: Министерство энергетики США. По состоянию на 14 сентября 2005 г. http: // cdiac.ornl.gov/trends/co2/lampis.html.
Рисунок 2
EPICA Dome C, Антарктида: приблизительно с 797 446 до н.э. по 1937 г. н.э.
Лоулерг, Л., А. Шилт, Р. Спани, В. Массон-Дельмотт, Т. Блунье, Б. Лемье, Ж.-М. Барнола, Д. Рейно, Т.Ф. Stocker, J. Chappellaz. 2008. Орбитальные характеристики и особенности атмосферного CH 4 в масштабе тысячелетия за последние 800 000 лет. Природа 453: 383–386. www.ncdc.noaa.gov/paleo/pubs/loulergue2008/loulergue2008.html.
Лоу Доум, Антарктида: примерно с 1008 г. по 1980 г.
Этеридж, Д.М., Л.П. Стил, Р.Дж. Фрэнси и Р.Л.Лангенфельдс. 2002. Исторические записи CH 4 из кернов льда Антарктики и Гренландии, данные антарктического фирна и архивные пробы воздуха с мыса Грим, Тасмания. В: Тенденции: сборник данных о глобальных изменениях. Ок-Ридж, Теннесси: Министерство энергетики США. По состоянию на 13 сентября 2005 г. http://cdiac.ornl.gov/trends/atm_meth/lawdome_meth.html.
Кейп Грим, Австралия: с 1985 г. по 2015 г. н.э.
NOAA (Национальное управление океанических и атмосферных исследований).2016 г. Среднемесячные концентрации CH 4 для мыса Грим, Австралия.
По состоянию на 16 июля 2016 г. ftp://ftp.cmdl.noaa.gov/data/trace_gases/ch5/flask/surface/ch5_cgo_surface-flask_1_ccgg_month.txt.
Мауна-Лоа, Гавайи: 1984–2015 гг.
NOAA (Национальное управление океанических и атмосферных исследований). 2016 г. Среднемесячные концентрации CH 4 для Мауна-Лоа, Гавайи. По состоянию на 16 июля 2016 г. ftp://ftp.cmdl.noaa.gov/data/trace_gases/ch5/flask/surface/ch5_mlo_surface-flask_1_ccgg_month.текст.
Шетландские острова, Шотландия: с 1993 г. по 2001 г. н.э.
Steele, L.P., P.B. Круммель и Р.Л.Лангенфельдс. 2002. Запись метана в атмосфере с Шетландских островов, Шотландия (версия от октября 2002 г.). В: Тенденции: сборник данных о глобальных изменениях. Ок-Ридж, Теннесси: Министерство энергетики США. По состоянию на 13 сентября 2005 г. http://cdiac.esd.ornl.gov/trends/atm_meth/csiro/csiro-shetlandch5.html.
Рисунок 3
EPICA Dome C, Антарктида: приблизительно 796475 г.
до н.э. — 1937 г. н.э.
Schilt, A., М. Баумгартнер, Т. Блюнье, Дж. Швандер, Р. Спани, Х. Фишер и Т.Ф. Stocker. 2010. Изменения концентрации закиси азота в атмосфере в ледниково-межледниковом и тысячелетнем масштабе за последние 800 000 лет. Quaternary Sci. Откровение 29: 182–192. ftp://ftp.ncdc.noaa.gov/pub/data/paleo/icecore/antarctica/epica_domec/edc-n2o-2010-800k.txt.
Антарктида: приблизительно с 1903 г. по 1976 г. н.э.
Батл, М., М. Бендер, Т. Соуэрс, П. Танс, Дж. Батлер, Дж. Элкинс, Дж.Эллис, Т. Конвей, Н. Чжан, П. Ланг и А. Кларк. 1996. Концентрации атмосферных газов за последнее столетие, измеренные в воздухе фирном на Южном полюсе. Природа 383: 231–235. ftp://daac.ornl.gov/data/global_climate/global_N_cycle/data/global_N_perturbations.txt.
Кейп Грим, Австралия: с 1979 г. по 2013 г. н.э.
AGAGE (Расширенный эксперимент по глобальным атмосферным газам). 2015 г. Среднемесячные концентрации N 2 O для мыса Грим, Австралия. Доступ 5 июня 2015 г.http://ds.data.jma.go.jp/gmd/wdcgg/cgi-bin/wdcgg/catalogue.cgi.
Южный полюс, Антарктида: 1998 г. — CE 2015 г.
Барроу, Аляска: 1999 г. — 2015 CE
Мауна-Лоа, Гавайи: 2000 г. — CE 2015 г. 2016. Среднемесячные концентрации N 2 O для Барроу, Аляска; Мауна-Лоа, Гавайи; и Южный полюс. По состоянию на 8 июня 2016 г. www.esrl.noaa.gov/gmd/hats/insitu/cats/cats_conc.html.
Subaru Дополнительная безопасность — Расширенная гарантия
Какие автомобили имеют право на дополнительную безопасность ® ?
Добавленная безопасность была создана исключительно для автомобилей Subaru. Любая модель Subaru, на которую по-прежнему распространяется основная гарантия Subaru of America, имеет право на добавленную безопасность, если только автомобиль не используется в коммерческих целях или не оборудован снегоочистителем.
Сколько стоит план дополнительной безопасности?
Стоимость плана варьируется в зависимости от условий плана (например,g.
, продолжительность страхового покрытия, франшиза и т. д.). Ваш местный продавец Subaru сможет предоставить вам конкретную цену для всех доступных планов. Свяжитесь с вашим местным продавцом для получения дополнительной информации или для начала процесса регистрации.
Как долго действует соглашение о предоставлении услуг?
Вы можете выбрать длину покрытия, которая наилучшим образом соответствует вашим потребностям. У вас есть выбор между восемью различными условиями тарифного плана. Вы даже можете выбрать план, который распространяется на ваш Subaru до 10 лет или до тех пор, пока он не накопит 100 000 миль пробега, в зависимости от того, что наступит раньше.Срок действия плана рассчитывается с момента начала заводской гарантии и составляет 0 миль.
Что делать, если у меня механическая поломка?
Постарайтесь вернуть свой Subaru продавцу Subaru, если вождение автомобиля не приведет к дальнейшим повреждениям. В противном случае вы можете позвонить по нашему бесплатному номеру обращения за помощью.
Дополнительная безопасность ценится на всей территории США и Канады.
Что делать, если мне нужна помощь на дороге?
Если ваш план включает покрытие помощи на дороге, Cross Country Motor Club отправит вам отдельный пакет, в котором будет указан номер круглосуточной бесплатной службы экстренной помощи, по которому можно позвонить, а также подробная информация о многих других услугах, доступных вам.
Придется ли мне платить франшизу?
Нет! Вы можете выбрать план с нулевой франшизой. Тем не менее, планы доступны с франшизой в 50 или 100 долларов — сумма зависит от вас.
Что делать, если я продам свой Subaru до истечения срока действия дополнительной защиты?
Для повышения стоимости при перепродаже вы можете передать оставшееся покрытие следующему владельцу за небольшую плату за обслуживание. Или, если хотите, вы можете отменить покрытие и подать заявку на пропорциональное возмещение.
Основы кухни: знай свою духовку
Возможно, один из самых сложных аспектов переезда на новую кухню — это сориентироваться.
Если вам не повезло, что ваша кухня построена в соответствии с вашими требованиями, вероятно, есть много «менее чем идеальных» вещей, с которыми вам придется научиться жить. Такова жизнь.
В таких ситуациях я обычно просто использую его. Я организовываюсь как могу и, как Борг, начинаю адаптироваться.Но одна вещь, которую стоит систематически исследовать, — это то, как нагревается ваша духовка. Большинство домашних духовок ужасно неточные и неровные. Большинство духовок можно откалибровать, поэтому купите себе дешевый термометр для духовки, вытащите руководство по эксплуатации духовки и постарайтесь откалибровать духовку как можно лучше.
Даже когда духовой шкаф откалиброван, вы можете быть шокированы тем, насколько велики колебания температуры. Когда-то мы жили в квартире, где температура духовки составляла 100 градусов, независимо от того, на какую температуру она была установлена.И хотя колебания вашей духовки могут быть не такими значительными, они все же случаются.
Такая вариативность кошмарна для составителей рецептов, и на самом деле нет никакого другого способа учесть ее, кроме как выдать стандартное предупреждение о том, как вы должны знать свою духовку и соответственно регулировать.
Вооружившись термометром, вы можете определить, насколько точен термостат вашей духовки и как температура изменяется с течением времени. Это простое и недорогое решение, которое улучшит ваш кулинарный опыт.Вы можете обнаружить, что вам нужно установить термостат выше или ниже в зависимости от того, холодная или горячая ваша духовка. Даже после калибровки вы можете обнаружить, что вам нужно вносить некоторые корректировки каждый раз при использовании духовки.
Еще одна вещь, на которую следует обратить внимание, — это страшная горячая точка. Вы когда-нибудь выпекали партию печенья только для того, чтобы обнаружить, что те, которые находятся за пределами противня, начинают гореть раньше, чем те, что в центре, готовятся? Или, может быть, задний левый угол вашей духовки становится горячее, чем где-либо еще.
Это может быть неприятной проблемой, особенно если вы выбираете метод проб и ошибок, чтобы изучить свою духовку. Мой любимый тест на горячие точки — это тест с белым хлебом.
Разогрейте духовку до 350˚F и поставьте решетку в центре духовки. Поместите ломтики белого хлеба в решетку на решетку духового шкафа и оставьте их, пока они не начнут поджариваться. Обратите внимание, какие ломтики поджариваются (и подгорают) быстрее других. Это укажет на более горячие участки внутри духовки.
К сожалению, для этих горячих точек нет никакого волшебного решения. Но, обладая знаниями о том, как работает ваша духовка, вы можете внести коррективы в свою готовку, чтобы уменьшить влияние горячих точек. Не ставьте формы для выпечки в самые горячие части духовки и переворачивайте противни, чтобы предотвратить подгорание или переваривание. Чтобы уменьшить влияние горячих точек, многие рецепты уже рекомендуют вам повернуть противни, но вы все равно должны это сделать.
Наконец, имейте в виду, что размещение решеток в духовке также повлияет на приготовление пищи.В большинстве (если не во всех) духовках вверху жарче, чем внизу. Таким образом, если у вас есть два противня в духовке, один на более высокой решетке и один на более низкой решетке, то лист на более высокой решетке будет готовиться быстрее. Поэтому важно вращать сковороды не только спереди назад, но и сверху вниз.
Примечание о конвекционных печах: одно из предполагаемых преимуществ конвекционных духовок заключается в том, что они производят более равномерный нагрев, но это не обязательно исключает возможность возникновения горячих точек.Часто область прямо перед вентилятором имеет тенденцию быть более горячей, чем окружающие области, поэтому имеет смысл провести тест на горячие точки с конвекционными печами. Также помните, что конвекционные печи обычно готовят продукты быстрее, поэтому, если у вас есть конвекционная печь, мы рекомендуем установить ее на 25 градусов ниже, чем указано в рецепте (если рецепт не написан специально для конвекционных духовок).
Чтобы уменьшить неравномерность нагрева духовки, я также рекомендую поставить камень для выпечки на нижнюю решетку духовки, пока он разогревается.Камень будет действовать как теплоотвод и уменьшать влияние горячих точек и колебаний температуры. Не используйте камень для запекания при жарке. Камень может треснуть или расколоться.
Стандарт для конструирования плазмид, практически без рубцов, с использованием многократно используемых частей ДНК
Химические вещества
Все химические вещества были приобретены у Sigma-Aldrich, если не указано иное. Все ДНК-олигонуклеотиды, используемые в этой работе, были синтезированы Integrated DNA Technologies и Guangzhou IGE Biotechnology LTD, а информация о последовательности ДНК-олигонуклеотидов представлена в дополнительных данных 1, 3, 4, 5, 6 и 7.
Протокол
Мы подготовили подробный пошаговый протокол и загрузили его в протокол обмена 26 .
PCR
Реакционный раствор для ПЦР в этой работе содержал 1–5 мкл матричной ДНК, 0,3 мкл 100 мкМ прямого олиго, 0,3 мкл 100 мкМ обратного олиго, 25 мкл Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix ( M0494, New England Biolabs [NEB]) и сверхчистой воды, чтобы довести объем до 50 мкл. Условия цикла были основаны на инструкции производителя.Все амплифицированные фрагменты ДНК разделяли стандартным гель-электрофорезом, а затем очищали с использованием коммерческой колонки в соответствии с инструкциями производителя (GeneJET Gel Extraction Kit, K0691, Thermo Fisher Scientific). В конце очистки ДНК элюировали из колонки с использованием 40 мкл воды, свободной от нуклеаз (BUF-1180, 1st BASE Biochemicals [1st BASE]) в 1,7 мл пробирке Eppendorf.
Химическая реакция на основе йода
Для разрыва связи PS в молекулах ДНК (рис. 1c) сорок микролитров очищенного раствора ДНК смешали с 5.5 мкл 1 М раствора трис (3021, 1-я ОСНОВА, pH доведен до 9) и 10 мкл 30 г раствора йода -1 (йод: 207772, Sigma-Aldrich; растворитель: этанол) и инкубировали при 70 ° C в течение 5 мин на водяной бане. Раствор разбавляли 250 мкл воды, свободной от нуклеаз, и очищали с использованием коммерческой колонки для очистки ДНК, как описано выше.
Получение фрагмента ДНК
Фрагменты могут быть амплифицированы из различных источников (например, плазмиды, синтетической ДНК, геномной ДНК) с использованием PS-модифицированных Foligos (рис.
1c и дополнительный рис. 6a). Расщепление связи PS на основе йода оставило два 1-нуклеотидных SE (C или T) на каждом фрагменте. Фрагменты, обработанные раствором йода, должны быть очищены с помощью колонки перед использованием в последующих приложениях (GeneJET Gel Extraction Kit, K0691, Thermo Fisher Scientific).
также могут быть амплифицированы с использованием немодифицированных олигонуклеотидов, содержащих выбранные RS типа IIS RE (фиг. 4a). Амплифицированный фрагмент будет использоваться в процедуре повторного переваривания и лигирования в одном горшке, как показано ниже в разделе «Ферментативное расщепление фрагмента в одном горшке и штрих-кодирование».
Короткие фрагменты могут быть созданы непосредственно путем отжига Noligos (дополнительный рис. 4a). Раствор для реакции отжига содержал 50 мкл 100 мкМ G-нолиго и 50 мкл 100 мкМ A-нолиго. Отжиг проводился с использованием следующей программы в термоциклере: 98 ° C в течение 2 минут, от 98 до 75 ° C со скоростью 0,1 ° C / с, 75 ° C в течение 2 минут, от 75 до 45 ° C со скоростью 0,1 ° C / с, 45 ° C в течение 2 минут, от 45 ° C до 4 ° C со скоростью 0,1 ° C / с и выдерживают при 4 ° C.
Фрагменты, полученные отжигом Noligos, разбавляли водой, свободной от нуклеаз, до 10–20 нг / мкл для штрих-кодирования и не требовали очистки.Все олиго, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительных данных 1.
Мы разработали приложение Matlab (GTS Oligo Designer), чтобы помочь исследователям разрабатывать Foligos (модифицированные и немодифицированные PS), Noligos и Boligos. Пошаговая инструкция по использованию приложения представлена в этом протоколе 26 . Приложение можно загрузить по ссылке https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/71880-oligo-designer-for-gt-standard. Если у пользователей не установлен Matalb, EXE-файл (https: // github.com / KangZhouGroupNUS / GTS-Oligo-Designer.exe.git) можно использовать для установки приложения.
Фосфорилирование и сворачивание Boligos
Boligos должны иметь фосфатную группу на 5′-конце и должны быть правильно сложены. Чтобы снизить стоимость синтеза олигонуклеотидов, мы заказали обычные олигонуклеотиды и использовали киназу Т4 для добавления фосфатной группы. Раствор для реакции фосфорилирования содержал 1 мкл 100 мкМ Boligo, 2 мкл 10X Т4 лигазного буфера (B0202, NEB), 0,5 мкл киназы Т4 (B0201, NEB) и 16,5 мкл воды, свободной от нуклеаз. Фосфорилирование и сворачивание Boligo были выполнены с использованием следующих условий в термоциклере: 37 ° C в течение 30 минут (фосфорилирование), 65 ° C в течение 20 минут (инактивация киназы Т4), 98 ° C в течение 2 минут (денатурация ДНК). , 98–45 ° С при норме 0.1 ° C / с, 45 ° C в течение 2 минут, от 45 ° C до 4 ° C со скоростью 0,1 ° C / с и выдерживать при 4 ° C. Приготовленный Boligos (разбавленный в 4 раза сверхчистой водой) можно использовать в последующих реакциях без очистки. Все Boligos (традиционный и новый дизайн олиго), использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительных данных 3. Рабочий процесс для создания обычных Boligos подробно описан на дополнительном рисунке 2.
Barcoding
Подготовленные фрагменты с 1-нуклеотидной SE были лигированы Boligos с использованием коммерческого набора (Blunt / TA Ligase Master Mix, M0367, New England Biolabs).
Тип лигазы имел решающее значение на этом этапе (результаты использования различных лигаз показаны на дополнительном рисунке 17). Раствор для реакции лигирования содержал 3 мкл фрагмента, 0,3 мкл 1,25 мкМ L (G / A) -Boligo, 0,3 мкл 1,25 мкМ R (G / A) -Boligo и 3,6 мкл основной смеси Blunt / TA Ligase Master Mix. Реакцию лигирования проводили в термоциклере по следующей программе: 25 ° C в течение 5 мин и выдержка при 4 ° C. Очень важно иметь достаточное количество высококачественного фрагмента в реакции лигирования. Рекомендуемая минимальная концентрация фрагмента составляет 10 нг / мкл для фрагмента длиной не более 1 т.п.н.Концентрация относится к концентрации фрагмента с 1-нуклеотидными SE. Если размер фрагмента превышает 1 т.п.н., мы рекомендуем использовать не менее 100 нг / мкл; если размер фрагмента превышает 2 т.п.н., мы рекомендуем использовать не менее 200 нг / мкл. Мы использовали Vacufuge (концентратор Eppendorf ™ Vacufuge ™) для концентрирования раствора фрагментов, когда его концентрация была слишком низкой. Спектр поглощения (200–300 нм) каждого раствора фрагмента следует исследовать с помощью Nanodrop (спектрофотометры NanoDrop ™ 2000 / 2000c, Thermo Fisher Scientific) или аналогичного устройства, чтобы убедиться в наличии пика при 260 нм, прежде чем можно будет использовать концентрацию его фрагментов. в расчете.
После лигирования соответствующие Aoligos (фиг. 5c) использовали для амплификации правильно закодированных фрагментов с помощью ПЦР. Этот этап получил название ПЦР с лигированием. Продукт лигирования непосредственно использовали в качестве ДНК-матрицы в ПЦР без очистки / разбавления. Продукт ПЦР очищали и расщепляли с помощью химической реакции на основе йода, если использовали PS-модифицированный Aoligos. Aoligos с или без PS-модификации, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительных данных 4. Все фрагменты со штрих-кодом, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительных данных 8.
Ферментативное расщепление фрагмента в одном горшке и штрих-код
Были протестированы четыре из пяти выбранных RE типа IIS (рис.
4b). Раствор для переваривания и лигирования RE содержал 1 мкл типа IIS RE (MboII [R0148S], HphI [R0158S], BmrI [R0600S] или BciVI [R0596S] NEB), 0,3 мкл 1,25 мкМ л (G / A) -Boligo , 0,3 мкл 1,25 мкМ R (G / A) -Boligo, 3 мкл фрагмента (концентрация фрагмента рекомендована в разделе «Штрих-кодирование») и 4,6 мкл основной смеси Blunt / TA Ligase Master Mix. Смесь для переваривания RE инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч, и два микролитра раствора использовали в качестве матрицы в ПЦР для амплификации фрагмента со штрих-кодом с использованием соответствующих PS-модифицированных Aoligos.Продукт ПЦР очищали и обрабатывали с использованием раствора йода, как указано в разделах «ПЦР» и «Химическая реакция на основе йода». Все немодифицированные олигонуклеотиды, использованные для амплификации фрагментов с 1-нуклеотидными SE, перечислены в дополнительных данных 1.
Прямая амплификация фрагмента со штрих-кодом
Фрагменты со штрих-кодом также могут быть напрямую амплифицированы из сконструированной плазмиды с использованием Aoligos из плазмиды.
если эта плазмида содержит фрагмент со штрих-кодом (рис. 6e – g и 7a, дополнительные рис.6а и 11а). В таком случае штрих-кодирование не требовалось. Продукты ПЦР могут быть расщеплены химической реакцией на основе йода, очищены и использованы для сборки ДНК.
Сборка ДНК
Мы использовали различные методы сборки ДНК в многоуровневых рабочих процессах (дополнительный рис. 16).
CLIVA 11 : раствор для реакции сборки содержал 1 мкл 10 мМ MgCl 2 и 4 мкл смеси, содержащей эквимолярные фрагменты со штрих-кодом. Рекомендуемая минимальная молярная концентрация фрагмента со штрих-кодом составляет 10 нМ.Использовали следующую процедуру: смесь нагревали с помощью термоциклера при 80 ° C в течение 1 мин, охлаждали до 68 ° C при стандартной скорости теплового цикла, выдерживали в течение 10 мин и затем охлаждали до 4 ° C при 0,1 ° C / с. Смесь для лигирования можно использовать непосредственно для трансформации.
Метод Гибсона: Раствор для реакции сборки содержал 4 мкл 2X Gibson Assembly Master Mix (E2611S, NEB) и 4 мкл смеси фрагментов, содержащей эквимолярные фрагменты со штрих-кодом.
Реакцию лигирования проводили при 50 ° C в течение 15 мин с использованием термоциклера.Смесь для лигирования можно использовать непосредственно для трансформации.
Клонирование in-fusion: раствор для реакции сборки содержал 1 мкл 5X In-Fusion HD Enzyme Premix (639645, Clontech) и 4 мкл смеси фрагментов, содержащей эквимолярные фрагменты со штрих-кодом. Реакцию лигирования проводили при 50 ° C в течение 15 мин с использованием термоциклера. Смесь для лигирования можно использовать непосредственно для трансформации.
Сборка Golden Gate: три плазмиды первого уровня были сконструированы под GTS, так что штрих-коды, включенные в RS BsaI и спейсер, можно было использовать для создания трех 4-ядерных SE в сборке на основе Golden Gate второго уровня (дополнительный рис. 10a и б).Раствор для ферментативного расщепления содержал 1 мкл BsaI (R3733S, NEB), определенное количество плазмиды (~ 1 мкг), 5 мкл 10X CutSmart ® Buffer, сверхчистую воду для доведения до 50 мкл реакционной смеси.
Растворы смеси для переваривания RE инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч, и целевые фрагменты разделяли с помощью гель-электрофореза. Раствор для лигирования содержал 0,5 мкл Т4-лигазы (M0202L, NEB), 0,5 мкл 10X лигазного буфера Т4, 4 мкл смеси, содержащей эквимолярный ферментативно переваренный фрагмент и остов.Реакцию лигирования проводили при 16 ° C в течение 12 ч с использованием термоциклера.
Метод на основе RE: сначала были сконструированы плазмиды первого уровня и секвенированы, чтобы гарантировать, что области штрих-кода содержат правильные сайты узнавания RE. Раствор для переваривания RE, использованный на дополнительном рисунке 11, содержал по 1 мкл каждого RE (NotI [R3189S, NEB] и I-CeuI [R0699S, NEB]), определенное количество плазмид (~ 1 мкг), 5 мкл 10X CutSmart ® Буфер (B7204S, NEB) и сверхчистая вода для добавления в реакционную смесь 50 мкл.Смесь для переваривания RE инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч, и целевые фрагменты разделяли с помощью гель-электрофореза.
Раствор для лигирования содержал 0,5 мкл Т4-лигазы, 0,5 мкл 10X Т4-лигазного буфера, 4 мкл смеси, содержащей ферментативно расщепленный штрих-кодовый фрагмент и фрагмент основной цепи (молярное отношение вставки к основной цепи составляло 3: 1). Реакцию лигирования проводили при 16 ° C в течение 12 ч с использованием термоциклера. Повторное переваривание и лигирование, использованные на дополнительном рис. 12, были аналогичны описанным выше, за исключением того, что использовались BamHI (R0136S, NEB) и AatII (R0117S, NEB).
трансформация E. coli : один микролитр сборочного раствора смешивали с 17 мкл E. coli Dh5α компетентных клеток теплового шока (C2987H, NEB) в предварительно охлажденной 1,7 мл пробирке на льду (кислород). Пробирку подвергали тепловому шоку на водяной бане при 42 ° C в течение ровно 35 с и гасили на льду в течение 2 мин. Раствор клеток смешивали с 150 мкл среды SOC (B9020S, NEB) и непосредственно высевали на чашку с агаром LB, содержащую правильный антибиотик.
Планшет инкубировали при температуре, необходимой для конкретных применений.Обычно колония появлялась через 12–16 ч при инкубации при 37 ° C.
ПЦР колоний и секвенирование по Сэнгеру проводили для определения эффективности сборки и точности секвенирования сборки ДНК. Точность сборки была продуктом эффективности сборки и точности последовательности. Эффективность сборки представляла собой отношение количества положительных колоний (определенное с помощью ПЦР колоний) к количеству всех протестированных колоний. Для каждой сборки ДНК одну или несколько положительных колоний культивировали в LB с соответствующими антибиотиками в течение ночи, а выделенные из них плазмиды дополнительно тестировали секвенированием по Сэнгеру (поставщик услуг: Axil Scientific, AITbiotech и BioBasic).Точность секвенирования представляла собой отношение количества положительных плазмид (свободных от мутации / делеций / вставок в секвенированной области) к количеству всех секвенированных плазмид. Необработанные данные, используемые для статистического анализа точности конструирования плазмиды (рис.
1d), представлены в дополнительных данных 9. Реакционный раствор колоний E. coli для ПЦР содержал 1 мкл суспензии колоний (одну единственную колонию ресуспендировали в 100 мкл ультрачистой смеси. вода), 0,15 мкл 100 мкМ прямого олиго, 0,15 мкл 100 мкМ обратного олиго, 5 мкл Q5 High-Fidelity 2X Master Mix и 3.7 мкл сверхчистой воды. Олиго, используемые в ПЦР колоний для тестирования различных методов сборки ДНК, перечислены в дополнительных данных 7.
Дрожжи in vivo сборка 24 : три плазмиды первого уровня (дополнительный рис. 14a) были ферментативно расщеплены, и высвобожденные фрагменты собирали в дрожжевую плазмиду (дополнительный рис. 14d). Раствор для переваривания RE содержал 1 мкл каждого RE (NotI [R3189S, NEB] и / или SrfI [R0629S, NEB]), определенное количество плазмиды (~ 1 мкг, PGTP1 или PGTP2), 5 мкл 10XCutSmart ®. Буфер и сверхчистая вода для добавления в реакционную смесь 50 мкл.Растворы смеси для переваривания RE инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч, и целевые фрагменты разделяли с помощью гель-электрофореза.
Полученные очищенные фрагменты (25 мкл) смешивали и концентрировали с помощью Vacufuge примерно до 5 мкл. Концентрированная смесь смешивалась с 50 мкл компетентных дрожжевых клеток ( S. cerevisiae BY4741 компетентная клетка была получена с использованием набора для трансформации S.c EasyComp ™ [K505001, Thermo Fisher Scientific]). Трансформацию дрожжей проводили в соответствии с инструкциями производителя, и трансформированные клетки культивировали на агаре CSM-URA при 30 ° C в течение 36–48 часов.Затем планшет с колониями визуализировали в Dark Reader (ручная лампа HL34T, Clare Chemical) для проверки их флуоресценции. Пять флуоресцентных и нефлуоресцентных колоний ресуспендировали в 100 мкл сверхчистой воды по отдельности. Для лизиса клеток десять микролитров каждой ресуспензии колонии смешивали с 10 мкл NaOH (40 мМ) и инкубировали при 98 ° C с использованием термоциклера в течение 30 мин. Один микролитр раствора для лизиса клеток использовали в качестве матрицы для диагностики. ПЦР. Олиго, используемые в ПЦР дрожжевых колоний, перечислены в дополнительных данных 7.
Редактирование генома
E. coliДля редактирования генома E. coli MG1655_ ΔrecA _ ΔendA _ DE3 мы использовали описанную двухплазмидную систему CRISPR-Cas9 27 . Плазмиды pTarget, использованные в этом исследовании, были перечислены в дополнительных данных 5. ПЦР колоний выполняли для оценки эффективности делеции гена в выбранных локусах. Полный список целевых локусов и олигонуклеотидов, используемых в ПЦР колоний, приведен в дополнительных данных 5.
Плазмиды и штаммы
Полный список плазмид и штаммов, использованных и созданных в этом исследовании, приведен в дополнительных данных 10. Все файлы GenBank плазмид, созданных в этом исследовании, были предоставлены в исходных данных. Каждый штамм E. coli и S. cerevisiae был получен из его родительского штамма посредством плазмидной трансформации.
Стандартный протокол электропорации был использован для трансформации плазмиды в E. coli . Трансформацию дрожжей проводили в соответствии с инструкцией использованного набора.
Конструирование комбинаторной библиотеки плазмид
Для конструирования вариантов M1 или M2 в конструкции первого уровня (рис. 7a) каждый фрагмент ( ppsA , aroE , tktA , aroG , tal или tyrA) кодировали штрих-кодом тремя наборами RG-Boligo / LA-Boligo: RBS1 / SRBS4, SRBS4 / SRBS2 и SRBS2 / 3UTR1. Фрагменты со штрих-кодом могут быть собраны в 12 плазмид, если они были правильно объединены (дополнительный рис. 9a). Каждую плазмиду проверяли с помощью ПЦР колоний и секвенирования по Сэнгеру (дополнительные данные 9, P294-P305).Каждую плазмиду M1 (~ 1 нг / мкл) использовали в качестве матрицы для амплификации одного фрагмента M1 (дополнительная фиг. 9a) с использованием RG-Aoligo (5UTR) и LA-Aoligo (3UTR2). Каждую плазмиду M2 (~ 1 нг / мкл) использовали в качестве матрицы для амплификации одного фрагмента M2 (дополнительная фиг.
9a) с использованием RG-Aoligo (3UTR2) и LA-Aoligo (N36). Эти фрагменты M1 и M2 считались штрих-кодами, потому что Aoligos использовались в ПЦР и, таким образом, могут быть непосредственно собраны в соответствии с нашим рабочим процессом (рис. 1c). Шесть фрагментов M1 и шесть фрагментов M2 были эквимолярно собраны с одним плазмидным остовом (штрих-кодом), чтобы создать смесь из 36 плазмид (библиотека плазмид).Технические детали на этом этапе: обработанные йодом фрагменты были смешаны, и 2 мкл раствора были смешаны с 34 мкл клеток, способных к тепловому шоку E. coli Dh5α, которые после трансформации были распределены на 90 мм LB агаре с надлежащим антибиотик; все полученные колонии ресуспендировали в 6 мл среды LB, и смешанные плазмиды экстрагировали непосредственно из этой суспензии. Были приготовлены две плазмидные библиотеки, и каждая библиотека имела различную плазмидную основу (pSC101 + Amp R или pAC + Spec R ).
Качество каждой библиотеки плазмид проверяли с помощью ПЦР колоний.
На вышеуказанном этапе после трансформации компетентных клеток смесью случайным образом отбирали колонии. Каждую колонию тестировали с использованием двух пар олигонуклеотидов. Первая пара нацелена на RO и ppsA (M1), и она будет генерировать ампликоны различной длины, когда колонии содержат плазмиды, которые имеют ppsA в разных положениях оперона (дополнительный рис. 9b). Точно так же вторая пара нацелена на tal (M2) и AR.Ожидаемая длина ампликона указана на дополнительном рис. 9c. Шесть колоний были протестированы для каждой библиотеки плазмид, и результаты ПЦР колоний показали, что каждая библиотека плазмид действительно содержала различные плазмиды (дополнительный рисунок 9b). Олиго, использованные для проверки колоний с помощью ПЦР, перечислены в дополнительных данных 6.
Два микролитра смеси плазмид из каждой библиотеки использовали для трансформации E.coli MG1655 Δ recA _Δ endA _Δ pheA _Δ tyrR _ DE3 с помощью стандартной процедуры электропорации.
Семьдесят две колонии были отобраны случайным образом для каждой библиотеки, и каждая колония была проверена для определения ее способности продуцировать p -куаровую кислоту. После скрининга были отобраны два верхних штамма-продуцента кумариновой кислоты p из каждой библиотеки, и содержащиеся в них плазмиды были секвенированы для выяснения ответственного расположения генов.
Культура бактерий и количественное определение метаболитов
Каждую плазмиду TPP1-16 использовали для трансформации E. coli TPS0 (генотип: MG1655 Δ recA _Δ endA _Δ pheA _Δ tyrR _ DE3 ) с помощью стандартного протокола электропорации.Полученные штаммы были названы TPS1-16. Для тестирования этих штаммов отдельную колонию инокулировали в LB с помощью 50 мкг / мл -1 спектиномицина и культивировали при 37 ° C / 250 об / мин в течение ночи. Сто микролитров суспензии клеток, выращенных в течение ночи, инокулировали в 10 мл среды K3 (состав указан ниже) с 50 мкг-мл -1 спектиномицина, и культуру инкубировали при 30 ° C / 250 об / мин до тех пор, пока плотность клеток не достигала 0,5.
–1,0 (OD600), при котором культура индуцировалась 0.1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Один миллилитр индуцированных клеток переносили в круглодонную пробирку Falcon на 14 мл. Если использовался PthrC3, индукция IPTG пропускалась. Культивирование клеток начинали в пробирке на 14 мл. Пробирку инкубировали при 30 ° C / 250 об / мин в течение 84 часов.
В конце инкубации сто микролитров 6 M HCl добавляли к 1 мл бульона для клеточных культур для растворения кристаллов тирозина. Смесь инкубировали при 37 ° C / 250 об / мин в течение 30 мин, а затем центрифугировали при 13,500 × g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость фильтровали с использованием 13 мм, 0.Нейлоновый фильтр 2 мкм.
Для измерения титра тирозина два микролитра отфильтрованного супернатанта, приготовленного в соответствии с указанным выше протоколом, анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, Shimadzu LC-10). Условия ВЭЖХ следующие: колонка Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 100 мм, использовался изократический поток (скорость потока 0,7 мл / мин, а подвижная фаза состоит из 10% [об.
/ Об.] Ацетонитрила и 90% [ об. / об. водного раствора, содержащего 0,1% [об. / об.] трифторуксусной кислоты), температура колонки составляла 30 ° C, и детектором был УФ-детектор (длина волны: 254 нм).
Для измерения титра кумаровой кислоты p триста микролитров подкисленной среды (без центрифугирования) смешивали с 700 мкл ацетонитрила, смесь инкубировали при 30 ° C в течение 1 ч, смесь центрифугировали при 13 500 × 900 10. g в течение 5 мин, и два микролитра супернатанта анализировали с помощью ВЭЖХ (Shimadzu LC-10). Условия ВЭЖХ следующие: колонка Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 100 мм, использовался изократический поток (скорость потока составляла 1 мл / мин, а подвижная фаза состояла из 35% [об. / Об.] Ацетонитрила и 65% [ об. / об.] водный раствор, содержащий 0.1% [об. / Об.] Трифторуксусной кислоты), температура колонки составляла 30 ° C, и в качестве детектора использовался УФ-детектор (длина волны: 285 нм).
Среда K3 состояла из 89,8% (об. / Об.) Основной среды K3, 10% (об.
/ Об.) Исходного раствора источника углерода и 0,17% (об. / Об.) Мастер-микса K3. Базальную среду K3 получали растворением 4 г (NH 4 ) 2 HPO 4 , 13,3 г KH 2 PO 4 , 60 мг L-фенилаланина в 1 л деионизированной воды, регулируя pH до 7 с использованием 6 M NaOH и автоклавирования раствора.Исходный раствор источника углерода представлял собой 200 г раствора глюкозы на л -1 (автоклавированный). Мастер-смесь K3 была приготовлена смешиванием 2,5 мл 0,1 М раствора цитрата железа (автоклавированного), 1 мл 4,5 г раствора тиамина L -1 (фильтрованного через фильтр 0,2 мкм), 3 мл 4 мМ Na 2 MoO 3 (автоклавировано), 1 мл исходного раствора микроэлементов 1000X K3 (автоклавировано) и 1 мл 1 M раствора MgSO 4 (автоклавировано). Мы приготовили маточный раствор микроэлементов 1000x K3, растворяя 5 г CaCl 2 ∙ 2H 2 O, 1.6 г MnCl 2 ∙ 4H 2 O, 0,38 г CuCl 2 ∙ 4H 2 O, 0,5 г CoCl 2 ∙ 2H 2 O, 0,94 г ZnCl 2 , 0,0311 г H 3 BO 3 и 0,4 г Na 2 EDTA ∙ 2H 2 O в 1 л деионизированной воды и этот раствор автоклавировали.
Культивирование и анализ GFP-экспрессирующих
E. coli Каждую плазмиду A0-A8 использовали для трансформации E. coli BL21 (DE3) (C2527H, NEB).Отдельную колонию инокулировали в LB с помощью 50 мкг / мл -1 спектиномицина и культивировали при 37 ° C / 250 об / мин в течение ночи. Пятьдесят микролитров суспензии клеток, выращенных в течение ночи, инокулировали в 5 мл среды K3 с 50 мкг-мл -1 спектиномицина, и культуру инкубировали в 50-мл пробирке Falcon при 37 ° C / 250 об / мин в течение 24 часов. Оптическую плотность 600 (OD600) клеточных суспензий определяли с помощью устройства для чтения микропланшетов (Varioskan LUX Multimode Microplate Reader, Thermo Fisher Scientific).Для каждого образца двести микролитров клеточной суспензии загружали в лунку 96-луночного оптического планшета и анализировали при следующих настройках параметров: длина волны возбуждения 483 нм, длина волны излучения 535 нм, время измерения 100 мс и ширина полосы света возбуждения и испускания составляли 12 нм.